关键词：PhaseⅠMetabolism，Metabolic Stability，Cytochrome P450，CYP450，Liver microsomes，Primary hepatocytes

药物代谢，也称为生物转化（biotransformation），是指药物在体内被吸收后，经过各种酶及体液环境的作用，发生化学结构改变的过程。药物在体内的生物转化主要分为Ⅰ相代谢反应（PhaseⅠMetabolism）和Ⅱ相代谢反应（PhaseⅡMetabolism）。这两种反应都生成了更具极性和水溶性的产物，使得药物更易通过胆汁和尿液排泄。而代谢稳定性（Metabolic Stability）则反映了化合物对生物转化的敏感性，直接影响其口服生物利用度和体内半衰期，进而关系到药物的安全性与有效性。因此，在药物研发的早期阶段，评估药物的代谢稳定性显得尤为重要。

与体内代谢稳定性研究相比，体外代谢稳定性研究排除了多种干扰因素，可以更直接观察药物的代谢特征。这种方法具有省时、稳定、高效的优点，适合候选药物的高通量筛选。本文将简要介绍药物体外Ⅰ相代谢稳定性的研究方法及数据分析，供参考。

一、药物Ⅰ相代谢概述

药物Ⅰ相代谢（PhaseⅠMetabolism）是指通过引入新基团或去除原有小基团的方式，进行的官能团反应，涵盖氧化、还原和水解等过程。在这些反应中，细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）是最重要的酶系，主要存在于肝脏的平滑内质网微粒体中，能催化烷烃、烯烃、芳烃和类固醇等化合物的氧化反应。该酶系由细胞色素P450与NADPH-细胞色素P450还原酶（FAD为辅基的黄素蛋白）组成，反应中需要分子氧和还原辅酶Ⅱ（NADPH）的参与，使得一个氧分子在进行反应时发挥两种功能。因此，此类酶被称为混合功能氧化酶，而由于其氧化产物多为羟化物，又被称作羟化酶。

此外，还有一些其它酶参与Ⅰ相代谢的还原反应，如硝基还原酶和偶氮还原酶，这些酶可以将硝基化合物和偶氮化合物还原为胺类；而参与水解反应的酶则包括酯酶、酰胺酶和糖苷酶等，负责催化相应化合物的水解，此过程显著降低或消除其生物活性。

由此可见，Ⅰ相代谢是药物代谢的关键环节，通过这一过程，药物分子的化学结构会发生改变，可能会引入或暴露某些官能团（如羟基、氨基等）。这些结构的变化将直接影响药物的性质，如药理活性、毒性及药代动力学特征，因此了解药物的Ⅰ相代谢稳定性至关重要，以便选择具有良好药代动力学特征的候选药物。

二、药物Ⅰ相代谢稳定性的体外研究方法

由于肝脏是药物代谢的重要器官，富含多种参与Ⅰ相代谢的酶，药物体外代谢稳定性研究多以肝脏为模型。常用的肝脏体外代谢模型包括肝微粒体（Liver microsomes）和原代肝细胞（Primary hepatocytes）。

（1）肝微粒体的体外温孵法实验

肝微粒体中丰富的Ⅰ相代谢酶，特别是以CYP450为主的微粒体混合功能氧化酶系统，可用于Ⅰ相代谢稳定性研究。在进行实验时，需加入相应的辅助因子NADPH以重组体外代谢体系。实验步骤如下：

1. 样本准备：肝微粒体（人、猴、犬、大鼠、小鼠等物种），微粒体蛋白终浓度建议在0.1mg/mL-1mg/mL之间；待测药物浓度一般为1μM，避免过高。
2. 温孵反应：将肝微粒体、待测药物溶液及NADPH再生系统混合于反应容器中，置于37°C环境中孵育一定时间（如0，5，10，15，30，60分钟）。每样本平行检测3次，并设置空白对照组、阴性对照组和阳性对照组。
3. 终止反应与样本处理：通过加入有机溶剂（如乙腈等）终止反应后，通过离心处理样本，取上清液进行检测。
4. 检测分析：采用HPLC、LC-MS/MS等分析技术测定样本中药物的原形残留量及代谢产物，分析药物的半衰期及固有清除率，从而评估其在Ⅰ相代谢中的稳定性。

（2）原代肝细胞的体外温孵法实验

原代肝细胞保留了完整的细胞结构，具备更完备的代谢酶系统和多样的清除途径，适合进行药物代谢稳定性试验。其主要步骤包括：

1. 原代肝细胞的获取与准备：可通过机械和酶消化等方法从新鲜肝脏获取原代肝细胞。细胞活力需检测达到80%以上，方可用于实验。反应体系中原代肝细胞浓度应在0.5-2×10⁶/mL之间调整。
2. 温孵反应：在适宜的条件下（如37℃、5% CO₂）进行孵育，时间可设定为0、15、30、60、90、120分钟。
3. 终止反应与样本处理：同样通过加入有机溶剂终止反应，离心后取上清液进行检测。
4. 检测分析：使用HPLC、LC-MS/MS等分析技术检测样本中药物原形及其代谢产物，以评估其在Ⅰ相代谢中的稳定性。

综上所述，肝微粒体和原代肝细胞均可用于体外温孵法研究药物的Ⅰ相代谢稳定性，具体选择要根据物质特性和实验需求而定。

三、IPHASE体外Ⅰ相代谢稳定性试验数据分析

在进行体外代谢稳定性试验时，需遵循一定标准。数据显示，如果药物发生代谢，则残余率应小于20%；在此情况中，三个平行数据间的变异系数（CV%）需控制在15%以内，若有两个时间点超限，则可选择合适条件取平均值。这项实验能帮助研究者稳定地评估化合物的代谢特性。

通过以上研究，确保我们可以有效地预测和分析药物的代谢稳定性。尊龙凯时将继续致力于研发高质量的生物试剂，助力药物开发及生命科学领域的研究，为科研工作者提供更加便利的产品和方法。

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