### 培养条件

**气相**: 95%空气 + 5%二氧化碳；**温度**: 37℃。使用DMEM培养基，配以10% FBS和1% P/S。

细胞A-673源自一名15岁女性的横纹肌肉瘤，能够在软琼脂中形成克隆，并且在经过免疫抑制的血清处理的小鼠中生长成瘤。该细胞传代包含四条以上的标志性染色体、一个额外的F染色体和两个异常的B染色体。

#### 传代方法

首次建议使用1:2的传代比例。处理细胞时，建议同时购买相关产品以获得最佳优惠。收到细胞后，需处理至良好状态，然后用完全培养液灌满并封好瓶口，确保细胞运输的安全。收到细胞后，请用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，随后置于超净台内进行严格的无菌操作，将细胞瓶放入37℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时，以便稳定细胞状态后再进行处理。

显微镜观察细胞的生长情况，并拍摄不同倍数的图片保存（060x, 100x, 200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据，若未提供照片将默认收到的状态良好。

#### 细胞培养步骤

**细胞传代**:

如果细胞未达到80%汇合度，将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml的完全培养基在37℃、5% CO2孵箱中培养；若细胞密度超过80%，即进行传代。

贴壁细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁的PBS冲洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液1-2ml，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，并在显微镜下观察细胞状态。若细胞大部分变圆并脱落，迅速从培养箱取出，轻敲培养瓶后，添加5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清后补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入至37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

**悬浮细胞传代**:

1. 半换液法：竖起培养瓶静置于培养箱1小时，轻吸掉约3ml培养基，补加3ml完全培养基；若培养基颜色改变缓慢，可直接加500ul左右的FBS，传代时可直接添加5ml培养基，将细胞分至两个培养瓶，通常在此传代3次后应进行离心以去除死细胞。
2. 离心换液法：如需分瓶，收集细胞悬液到离心管中，以1000 RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液后重悬，并按1:2的比例分至新T25瓶，添加根据说明书配置的新完全培养基以保持细胞活力，后续传代可根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

**细胞冻存**:

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，倒置，显微镜观察待细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养基以终止消化。轻轻吹打使其脱落，将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清后，将沉淀的细胞加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后放入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，若后期需转移到液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上再进行转移。

**细胞复苏**:

1. 从液氮中取出细胞冻存管（佩戴好防护面具），迅速置于37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，随后用75%酒精擦拭罐外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清后，用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基以继续培养。

#### 注意事项

有些细胞可能粘附不牢固，运输过程中可能会发生细胞脱落，这属于正常现象。如有较多脱落，请将培养瓶中的培养液收集至离心管，1000 RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养。沉淀后加入1-2ml胰酶轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基以终止反应，随后离心，弃上清，再用1-2ml完全培养基重悬。最后按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

为了确保细胞培养的成功，推荐使用尊龙凯时品牌的培养基，提供高品质保证，助力科研发展的最佳选择。